聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。

一、 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)

PCR由變性–退火–延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：① 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;③ 引物的延伸：DNA模板–引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。④ 重復(fù)循環(huán)變性–退火–延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開(kāi)始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。

試劑DNA模板，與特定DNA模板結(jié)合的引物，去離子水，商業(yè)化的DNA聚合酶以及緩沖液，dNTP, MgSO4（可選）和DMSO（可選）

PCR反應(yīng)開(kāi)始前的準(zhǔn)備工作PCR反應(yīng)開(kāi)始前，你需要準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或者反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動(dòng)設(shè)計(jì)或利用軟件設(shè)計(jì)）并選擇合適的商業(yè)化DNA聚合酶（根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的不同做出決定）。

1. DNA聚合酶的選擇。市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇最適合自己實(shí)驗(yàn)需要的產(chǎn)品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到?jīng)]有任何突變的PCR產(chǎn)物，那應(yīng)當(dāng)選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Taq聚合酶已經(jīng)足夠。另外要注意的一點(diǎn)是，進(jìn)行T載體連接的時(shí)候，要了解高保真的聚合酶所得的產(chǎn)物是沒(méi)有A末端的，因此你在T載體連接之前需要進(jìn)行加A反應(yīng)?；蛘咧苯舆x用普通的Taq聚合酶。2. 引物。引物特異性會(huì)影響到PCR反應(yīng)成功的可能性，好的引物設(shè)計(jì)對(duì)PCR成功至關(guān)重要。設(shè)計(jì)引物時(shí)，有以下幾條原則需要謹(jǐn)慎考慮：1. 引物長(zhǎng)度。通常PCR引物長(zhǎng)度在18-22個(gè)堿基之間。這對(duì)引物的特異性以及退火溫度而言均已足夠。2. 解鏈溫度Tm。Tm值的定義是使得一半雙鏈DNA解螺旋成為單鏈DNA的溫度。引物的Tm值通常要在52-58度之間。3. GC含量。最適合的GC含量為40-60%。就目前而言很多軟件都可以用來(lái)設(shè)計(jì)引物，如primer5和Oligo。通常這些軟件設(shè)計(jì)得到的引物均可以滿足需要。

步驟準(zhǔn)備好各種試劑和PCR儀，就可以開(kāi)始PCR實(shí)驗(yàn)：將各種試劑混合并按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置PCR反應(yīng)。一般PCR循環(huán)如下：

1. 起始步驟：這對(duì)于熱啟動(dòng)PCR而言是必須的，將反應(yīng)混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時(shí)間取決于所選用的DNA聚合酶。2. 變性步驟：DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，而DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合。在這一步，反應(yīng)混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環(huán)中的第一步。3. 退火步驟：變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在。因?yàn)榉磻?yīng)體系中的引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50-65度時(shí)，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。這一步通常維持20-40秒，而聚合酶會(huì)結(jié)合至引物-模板雙鏈處開(kāi)始DNA合成。4. 延伸步驟：在這一步，DNA聚合酶開(kāi)始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的最優(yōu)溫度。通常我們選用72度，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補(bǔ)規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時(shí)間取決于目的DNA片段的長(zhǎng)度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長(zhǎng)度的DNA。5. 第2步至第4步稱為一個(gè)循環(huán)：每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)。在前幾輪的PCR循環(huán)過(guò)程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長(zhǎng)，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制。6. 最后的延伸步驟：當(dāng)30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，我們通常會(huì)以68-74度延伸5-10分鐘，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢。7. 維持時(shí)間：通常我們?cè)O(shè)置4-10度為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。

二、PCR常見(jiàn)問(wèn)題匯總

1. 無(wú)擴(kuò)增條帶（1）酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過(guò)更換新酶或用另一來(lái)源的酶以獲得滿意的結(jié)果。（2）模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。（3）變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過(guò)高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過(guò)低則模板變性不徹底。（4）反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10分鐘。（5）引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。（6）引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。（7）DNA凝膠電泳時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問(wèn)題。

2. PCR產(chǎn)物量過(guò)少（1） 退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。（2） DNA模板量太少。增加DNA模板量。（3） PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。（4） 引物量不足。增加體系中引物含量。（5） 延伸時(shí)間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延伸時(shí)間。（6） 變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。（7） DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈

3. 擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散（1）酶量過(guò)高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來(lái)源的酶。（2）dNTP濃度過(guò)高。減少dNTP的濃度。（3）MgCl2濃度過(guò)高。可適當(dāng)降低其用量。（4）模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。（5）引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。（6）循環(huán)次數(shù)過(guò)多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。（7）退火溫度過(guò)低。（8）電泳體系有問(wèn)題：①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；②凝膠沒(méi)有凝固好；③瓊脂糖質(zhì)量差。（9）若為PCR試劑盒則可能：①由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；②試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。（10）降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

4. 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶 （雜帶）（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。（2）循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。（4）退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。（5）樣品處理不當(dāng)。（6）Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。（7）若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。（8）復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。（9）反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。（11）引物量過(guò)多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。（12）模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。

5.陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶試劑，槍頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。6.條帶大小與理論不符1) 污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。2) 模板或引物使用錯(cuò)誤。更換引物和模板。3) 基因亞型。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。